La diócesis fue erigida el 10 de abril de 1859 con bula In excelsa del papa Pío IX, con territorio desmembrado de la diócesis de Popayán (ahora Arquidiócesis).

Inicialmente la diócesis de Pasto contaba con una extensión de 800.000 km², correspondiéndole toda la parte sur de Colombia.

El 20 de junio de 1900 se convirtió en parte de la provincia eclesiástica de la Arquidiócesis de Popayán.

El 20 de noviembre 1904 cedió una porción de su territorio en favor de la erección de la prefectura apostólica del Caquetá (en la actualidad la Diócesis de Mocoa-Sibundoy).